二级生物安全柜运用时先用遥控器开启隔离窗，窗体警报器随即响起，当窗体向上滑动到适宜的工作高度时，警报声解除，即可开端工作。平安柜内不放与本次实验无关的物品，操作前应将实验所需的全部物品移入平安柜（工作用纸，小鼠垫料等易吹起的物品不许放在生物平安柜内以免阻塞回风隔栅），防止操作中双臂频繁穿过气幕毁坏气流；并且在移入前用70%酒精擦拭外表消毒，消毒工作台面。柜内物品摆放应做到清洁区、半污染区与污染辨别开，在柜内摆放的物品应该尽量呈横向字摆开，操作中物品取用便当，防止回风过程中形成穿插污染。物品应尽量靠后放置，但不得挡住气道口，以免干扰气流正常活动。
翻开风机5~10分钟，待柜内空气净化并气流稳定后再停止实验操作。将双臂应该垂直地缓缓伸入平安柜内，少静止1分钟，使柜内气流稳定后再停止操作，柜内操作时手应该尽量平缓挪动。操作中如的确需求拿出手臂或物品进入，也应垂直地缓缓进出，且可能接触感染物品，要对手套及手臂停止外表消毒；
防止震动准绳：柜内尽量防止震动仪器（例如离心机、旋涡振荡器等）的运用，由于震动会使得积留在滤膜上的颗粒物质抖落，招致操作室内部干净度降低，同时假如在前操作面均衡失败还会惹起平安柜对操作者的污染。如必需则放置在靠近柜内后壁1/3处，干净的物品应放置在间隔产生气溶胶器皿少150mm外。
